1. 产品描述：

信励致和^® 2×热启动染料法qPCR预混液(无ROX)是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂，可对目的片段进行快速、高效、特异性的定量检测。预混液中包含经过基因工程改造的的热启动DNA聚合酶、精心优化的缓冲液体系、优化的SYBR Green I浓度以及PCR反应增强剂，使产品具有特异性强、扩增效率高、扩增曲线标准等特点，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的qPCR结果。本产品为浓度2×的预混液，使用时只需添加模板、引物和dd H₂O，使预混液工作浓度为1×即可。

2. 产品特点：

（1）超快的延伸速度(10 s/kb)。

（2）灵敏度高、特异性强、稳定性好。

（3）高效的热启动酶，有效避免引物二聚体和非特异性扩增。

1. 产品组分：

2. 储运条件：

-25～-15°C避光保存，保质期12个月。干冰运输。

3. 注意事项：

（1）本品尽量避免反复冻融，以免酶活下降。如每次使用量较少，推荐小份分装使用。

（2）使用前请上下颠倒以混匀预混液，请勿强烈涡旋以免产生过多气泡引起反应体系体积失准，进而影响定量结果。预混液经混匀轻微离心后即可使用。使用过程中吹打需轻柔，避免使预混液起泡。

（3）由于本品中含有荧光染料SYBR Green I，因此无论保存预混液还是配制反应体系时都应该尽量避免强光照射。

（4）由于本品检测灵敏度极高，即使空气中微量的DNA气溶胶都可以引起污染，进而导致实验失败。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用干净灭菌枪头、离心管，推荐使用带滤芯的枪头。

（5）本产品请勿反复冻融。本产品保存或使用时应避免强光照射。

（6）所使用仪器类型不同，熔解曲线采集程序不尽相同，使用仪器默认熔解曲线采集程序即可。

1. 线性关系测试：

图1是将HEK293细胞的cDNA 进行梯度稀释的扩增曲线，图2是根据图1的CT 值绘制的标准曲线。结果表明，预混液在宽广的模板量区间具有优异的线性关系，且灵敏度较高。

2. 特异性测试：

以人源的cDNA 为模板，使用2×热启动染料法qPCR预混液(无ROX)在同样的反应条件下测试不用的目的基因，用以检测扩增特异性。统计结果显示。本品能够完成目标基因检测，特异性较高。

3. 模板兼容性测试：

使用本品及竞品分别以鼠源cDNA 、人源cDNA 为模板检测GAPDH基因的表达，上图为扩增曲线，图示结果显示，本品的扩增曲线优异，重复性好。

1. 无Ct值或偏大？

原因分析：模板浓度过低或降解；模板纯度低，蛋白质、盐等杂质会影响PCR扩增和荧光检测；引物扩增效率低；目的基因表达量低；反应循环数不够；qPCR体系污染；存在引物二聚体。

解决方案：适当增加模板用量，检查模板是否降解，使用新鲜制备的模板；重新制备高质量的模板或对模板进行稀释，降低杂质浓度；重新设计高质量引物；提高模板中目的基因含量，如使用特异性引物进行反转；循环数设置为40；使用RNase-free耗材；进行溶解曲线分析，结合高浓度琼脂糖凝胶电泳辅助判断是否为二聚体，若是则需重新设计引物。

2. Ct值重复性差？

原因分析：加样误差；模板浓度过低；仪器误差。

解决方案：使用优质耗材与移液器，避免加样挂壁，模板浓度不宜过高；减少模板稀释倍数；选择适用仪器，定期校准。

3. 熔解曲线多峰？

原因分析：存在引物二聚体；非特异性扩增；基因组污染。

解决方案：进行熔解曲线分析，结合高浓度琼脂糖凝胶电泳，判断是否为二聚体，若是则需重新设计引物；重新设计引物；去除基因组DNA，或跨内含子设计引物。