1. 没有Ct值?
原因分析:扩增后未出现Ct值可能的原因有,循环数不够;PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误;引物或探针降解;模板量可能降解或上样量不足。
解决方案:针对以上问题,建议适当增加循环数,为保证扩增特异性,不宜超过35个循环;通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融。
2. 扩增曲线异常?
原因分析:遇到扩增曲线异常,有可能是以下环节存在问题:模板的浓度太高或者降解;荧光染料的降解;液体挥发;扩增体系存在气泡。
解决方案:在操作前确认模版未被降解;RT-qPCR SYBR Green Kit避光保存避免反复冻融;在操作时扣紧PCR小管的盖子;使用移液枪加样时,减少气泡,将生成的气泡戳破。
3. 熔解曲线不止一个主峰?
原因分析:引物设计不够优化;同源性比较高;模板有基因组的污染。
解决方案:设计引物时应避免引物二聚体和非特异性扩增出现;被检测基因在待检测样品有同源性较高的序列;RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。