1. 扩增产量低或者无法扩增?
原因分析:出现产物量低或者扩增无条带一般有以下原因:PCR 反应中加入的裂解液过量;裂解液中混入了PCR抑制物;模板加入量不适合;PCR 循环数不够;循环反应退火温度设置太高;PCR 引物错配严重。
解决方案:减少裂解液用量;或将裂解产物稀释10倍后再进行PCR扩增;或增大PCR反应体系;裂解产物用量不应超过PCR反应总体积的1/10;增加PCR循环数以获得更好的扩增效果;降低退火温度(每次降低3℃);重新设计引物并在BLAST检测引物的特异性。
2. 非特异性扩增?
原因分析:PCR退火温度太低;循环数太多;或引物浓度/模板浓度太高;未在冰上配制PCR反应体系;或配制完成后放置时间太久;PCR 引物错配。
解决方案:升高PCR退火温度;减少PCR循环数;降低引物浓度或模板浓度;重新设计PCR引物。